肝纤维化：非酒精性脂肪性肝炎治疗药物Ⅲ期临床试验的最重要指标

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编者按：非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是影响全球上亿人的一个重要健康问题，迄今为止尚无任何FDA批准的特效药物。令人振奋的是，2019年见证了NASH新药发现和开发方面的进步，FDA有望在2020年批准首个 NASH新药。《药学进展》与中国NASH新药联盟、药时代携手合作，开辟NASH专栏，旨在汇聚行业专家智慧，报道NASH最新研究进展，探讨高效开发新药的战略战术，提升中国NASH新药研发的整体水平，以推动和加快NASH新药的研发上市，惠及中国及全球患者。

专家介绍：丁佳博士

复旦大学上海医学院医学博士，上海市静安区中心医院消化科主治医师，2019年获美国哈佛大学医学院全球临床学者培训项目认证，现任上海市医学会消化系病专科分会肿瘤学组成员、上海市中西医结合学会消化系统疾病专业委员会青年委员、上海市医学会肿瘤靶分子专科分会青年委员会委员和上海市医学会临床流行病学与循证医学专科分会青年委员会委员。主要从事肝细胞癌耐药和转移机制的基础和临床研究，研究成果发表于 Oncogene、Lab Invest、J Cell Mol Med等学术期刊，现获国家自然科学基金及上海市自然科学基金等资助。

专家介绍：吴健教授

医学博士，现任复旦大学基础医学院教授、复旦大学附属中山医院消化科双聘教授。获瑞典乌默尔大学医学博士学位，美国托马斯杰斐逊大学博士后。在美国加利福尼亚大学戴维斯分校医学院医学中心内科学胃肠病学及肝脏病学专科先后任助理教授、副教授及教授达15年。曾获美国肝病研究基金会授予的“肝病学者”称号，2011年荣获“上海市千人计划专家”称号。2017年被美国肝病研究会授予该会会士（AASLD fellow）称号。先后获美国国家研究服务奖、新颖探索课题研究奖、美国癌症基金会“新颖科研奖”。在权威专业刊物如Gastroenterology、Hepatology、Journal of Hepatology、Cancer Research等发表SCI文章125余篇。总引用次数达 7000余次。参与法国INSERM、英国RCUK、荷兰STW、纽约干细胞委员会NYSTEM计划、中国NSFC重点项目评审和教育部“科技进步奖”、“长江学者”、科技部重大专项评审。现受国家自然科学基金及科技部重点项目资助，主要从事代谢性肝病、炎症与癌变及再生医学治疗研究。正文

肝纤维化：非酒精性脂肪性肝炎治疗药物Ⅲ期临床试验的最重要指标

王中华 1，丁佳 2*，吴健 1,3,4** （1. 复旦大学基础医学院病原生物学系，上海 200032；2. 上海市静安区中心医院消化科，上海 200040；3. 复旦大学附属中山医院 消化科，上海 200032；4. 复旦大学上海医学院上海市肝病研究所，上海 200032）

[摘要]非酒精性脂肪性肝炎可向纤维化进展，肝纤维化的严重程度直接影响患者的生活质量和远期生存率。目前正在进行或已完成的非酒精性脂肪性肝炎治疗药物Ⅲ期临床试验，将能否阻止肝纤维化进展作为判断药物疗效的最主要终点指标之一。因此，了解肝纤维化机制及其相应干预靶点对非酒精性脂肪性肝炎的治疗尤为重要。概述非酒精性脂肪性肝炎及肝纤维化的病理生理特征、临床终点指标、相关靶点及临床在研药物的研究进展。

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是由代谢异常所致的一类肝病，在初期单纯性脂肪肝，即非酒精性脂肪肝（NAFL）阶段可通过饮食或运动干预达到逆转的效果，发展至非酒精性脂肪性肝炎（NASH）阶段可引发一系列炎症反应及肝细胞损伤，诱发纤维化。由于目前对NASH及肝纤维化尚无有效治疗手段，在评估治疗NASH候选药物疗效时，寻求合理有效终点指标成为NASH治疗的关键。笔者查阅和结合近年来本团队研究及中外文献，阐述NASH肝纤维化相关的病理生理机制，归纳总结正在进行的Ⅱ期和Ⅲ期临床试验药物，旨在为NASH治疗策略提供理论依据，并进一步评估相应纤维化干预靶点的合理性和有效性。
NAFLD是以肝细胞脂肪变性为主要特征，与营养代谢异常密切相关的一类肝脏疾病。随着肥胖、糖尿病和代谢综合征的广泛流行，NAFLD患病率逐年增加，已经成为影响全球的健康问题。由于乙型肝炎病毒（HBV）疫苗预防接种的普及和抗病毒药物的有效治疗，HBV的发病率正在逐年降低。而我国非酒精性脂肪性肝病的发病率已达15%，最近的报道已达29.2%，远超过HBV及丙型肝炎病毒（HCV）感染率的总和，并有向低龄化发展的趋势。既往观点认为NAFLD进入肝硬化期后才会出现原发性肝癌（HCC）。但最新临床研究发现，发生于NASH的HCC呈上升趋势，不明原因的HCC大多起因于NASH，并且HCC可出现于不伴明显肝硬化的NASH患者。NASH相关肝癌已成为美国近年来肝癌发病率持续上升的主要原因。有报道表明，NASH相关肝硬化患者71%伴有糖尿病，这类患者5年内HCC发生率可达10.2%，高于其他肝硬化并发肝癌的概率。因此，NASH纤维化进展至肝硬化和肝癌的高发生率越来越受到肝病学者的重视，笔者所在课题组在此领域也取得一些实质性的研究进展。

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非酒精性脂肪性肝炎及肝纤维化的病理生理特征

NASH患者多伴有肥胖、代谢综合征、糖尿病和高脂血症等，不同NAFL个体进展至NASH的过程和机制也不同。因此，NASH是一种多病因、个体差异较大、脂毒性造成的肝脏慢性疾病。NASH的主要病理特征为肝细胞脂肪变伴有气球样变性，合并小叶内炎症。病理上常以肝细胞脂肪变程度、气球样变性、炎症细胞浸润分级作为NAFLD活动性评分（NAS）。NAS小于等于4为NAFL，而高于此值则是诊断 NASH的病理依据。持续的肝细胞损伤及炎症反应启动修复过程，这一过程包括肝细胞的再生和以胶原纤维为主细胞外基质的沉着，即纤维化的过程。正常情况下肝脏纤维组织的形成和降解保持在一个动态平衡的状态。但是在脂毒性的作用下，肝细胞发生坏死、凋亡及肝组织炎症反应，激活Kupffer细胞分泌多种细胞因子，如转化生长因子（TGF-β）、血小板源性生长因子（PDGF）、结缔组织生长因子（CTGF）等，进一步激活肝星状细胞（HSC）并转变为肌纤维母细胞，发生表型和功能转变，通过旁分泌和自分泌机制，不断刺激HSC自身分裂增殖，合成和分泌大量胶原等多种细胞外基质，同时激活其他尚处于“静息”状态的HSC，造成动态平衡被破坏，纤维组织形成增多而降解减少，最终导致肝纤维化。因此，HSC的活化及增殖被认为是肝纤维化启动及持续因素，同时HSC本身也是肝纤维化的效应细胞。不同病因所致肝纤维化有各自的特点。NASH伴发肝纤维化的特征为肝细胞周围及肝窦区域纤维化沉积，后期出现汇管区纤维化。NASH伴发肝纤维化早期随着肝细胞脂毒性减轻，炎症反应缓解，纤维化有可能逆转。但若NASH不加控制，肝纤维化将逐渐加重。判断肝纤维化严重程度最可靠的方法是肝活检病理分级，根据公认的标准分为F1~F4期。NASH肝纤维化的程度大多处于F1~F2期，部分可进展到F3~F4期，后者出现表明已进入重度纤维化及肝硬化期。研究证明，肝纤维化分期与NASH患者生存期呈负相关，F3和F4期患者的生存年限较无肝纤维化NASH患者分别减少约10和20年。

脂毒性肝损伤是NASH主要的病理生理机制，代谢综合征和内脏脂肪组织堆积会引起肝内脂质积累，从而通过氧化应激、线粒体功能障碍、内质网应激、胰岛素抵抗等多种途径引起肝细胞损伤。此外，肠道微生态改变，短链脂肪酸、脂多糖、DNA、多胺代谢物等细菌产物对肝脏脂肪积蓄、炎症应答、胰岛素抵抗起推动作用，进而促进肝纤维化发展。由此，持续脂毒性肝细胞损伤和炎症应答很可能是肝纤维化进展的诱导、维持和促进因素。笔者所在课题组的研究也表明脂肪酸所致的肝细胞凋亡以及炎症小体活化是引起肝细胞损伤和纤维化的主要途径。此外，最近研究发现肝细胞线粒体损伤导致三羧酸循环障碍，琥珀酸积蓄释放入细胞间质，通过HSC表面的GPR-91受体导致HSC活化，是NASH肝纤维化进展的重要分子基础，这为干预NASH肝纤维化进展提供了有效治疗靶点。
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肝纤维化与非酒精性脂肪性肝炎患者的生活质量和生存期显著相关

NASH患者肝功能损伤指标如转氨酶等升高程度不如病毒性肝炎、药物性肝炎明显，单纯性肝脂肪变往往无明显生化指标异常。当进展至NASH时才表现出轻度肝功能检查异常，很少出现黄疸，往往不引起患者的重视，就诊率较低。早期肝纤维化也不一定出现显著临床症状和体征，常在影像学检查时发现。肝纤维化出现是疾病活动的表现，而肝纤维化的严重程度是NASH患者发生并发症和死亡的重要危险因素。一项多中心回顾性研究纳入619例NAFLD患者，分析了起始组织学以及随后平均12.6年随访结果。其NAFLD的入选标准为影像学确诊肝脂肪样变，同时满足谷丙转氨酶（ALT）持续高于正常值。该研究发现，主要肝脏相关事件如肝移植等的危险率在NASH和非NASH观察对象之间没有显著差异，但伴有肝纤维化患者出现肝脏相关事件的危险率显著高于无肝纤维化者。虽然这些主要终点事件的危险率在不同NAS分级间没有明显差异，但会随着纤维化分级增加而升高。因此，评估肝纤维化对判断NASH的严重程度和疾病进展尤为重要，也是疾病随访的重要内容。
Hagström等对646名经肝活检证实的NAFLD患者进行了回顾性队列研究，在校正年龄、性别和2型糖尿病等因素后，12％NAFLD患者和2.2％对照组在平均20年随访中患有严重肝病（P<0.001）。与对照组相比，肝纤维化分期和患严重肝病的风险成正比（危险比从F0期的1.9升至F4期的104.9）。与无纤维化的NAFLD患者相比，伴F3和F4期纤维化的NASH患者死亡率显著升高。2019年美国肝病年会发表的一项随访长达22年、纳入13427例患者的研究表明，严重肝纤维化是引起NAFLD患者死亡率上升的主要危险因素之一。因此，肝病科医师应密切监测F3和F4期NAFLD患者，评估其出现肝脏相关并发症的可能性。

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非酒精性脂肪性肝炎治疗药物的临床终点指标

多家药企正在进行的Ⅲ期临床试验的主要临床终点集中在改善F2~F3期纤维化，延缓NASH的进展，而Ⅱ期临床试验的终点主要集中于药物的安全性、耐受性及降低NAS评分。对于Ⅱa期临床试验，许多试验初步评价药物能否改善肝脂肪变，并不需要实施肝活检，将核磁影像检测质子密度脂肪分数（PDFF）作为肝脂肪含量的判断指标。由于肝纤维化无可靠非创伤性检查指标，Ⅲ期临床试验仍将肝活检作为评估NASH和纤维化严重程度的“金标准”。作为侵入性检查，肝活检操作具有一定的风险性，也存在取样及病理评判误差。超声FibroScan检测肝硬度（LSM）是一项无创性评估肝纤维化技术，其配备的受控衰减参数（CAP）软件可对肝脂肪变进行定量分析，提高NAFLD患者瞬时弹性成像测量LSM的准确性。而磁共振二维实时剪切波弹性成像（SWE）在判断肝纤维化程度方面已成为一种很有前景的无创影像学手段。目前对胰岛素抵抗大多采用实验室诊断指标，如糖耐量试验、空腹胰岛素、糖化血红蛋白水平等。总之，在无其他生化或影像学检查可替代的情况下，对于Ⅲ期临床试验，采用肝组织活检进行NAS和肝纤维化半定量评分是判断受试者NASH及肝纤维化是否进展和消退最有说服力的指标。

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非酒精性脂肪性肝炎和肝纤维化的相关靶点及临床在研新药

如前所述，肝脏脂肪累积及脂毒性是NASH肝损伤的起始原因。肥胖、代谢综合征、糖尿病等都会出现胰岛素抵抗，肝内脂肪分解减少，加剧肝脏脂肪蓄积。胰岛素抵抗还会促进脂肪因子和炎性细胞因子的产生和分泌，造成线粒体功能异常、氧化应激和内质网应激。上述营养代谢异常引起持续性肝脏炎症和修复应答，HSC 活化及细胞外间质的合成增加，最终导致肝纤维化。反映肝脏脂肪沉积、肝细胞炎症损伤和胰岛素抵抗等无创性指标易于监测，但由于无可靠非侵入性肝纤维化评价指标，将肝活检组织学改善（纤维化程度至少降低1个级别）作为NASH药物治疗的Ⅲ期临床试验主要终点指标往往难以达到，临床效果难以令人满意。NASH涉及多种发病机制，针对每种机制的关键分子靶点已经被应用到新型治疗药物的研发中，其中几种已在前期临床试验中显现出希望，在此重点介绍进入Ⅱ期和Ⅲ期临床试验的NASH治疗药物及其作用机制。
赖氨酰氧化酶样蛋白-2（LOXL2）是一种与胶原蛋白交联相关的酶，其在肝纤维化组织中高表达。尽管单克隆抗体治疗NASH模型动物的研究显示LOXL2抑制剂可以改善肝纤维化，但GS-6624（Gilead Sciences）对于伴有显著纤维化的 NASH患者的随机、双盲、安慰剂对照的Ⅱb期临床试验未能达到改善肝纤维化的主要终点指标。另一种化合物selonsertib，是凋亡信号通路调节激酶1（ASK-1）抑制剂。ASK-1是氧化应激以及内质网应激的关键激酶，参与肝细胞凋亡、Kupffer细胞活化及HSC激活。其抑制剂selonsertib在临床前期被认为是有希望的制剂之一，因其能对NASH及肝纤维化的多个环节起到抑制作用。在早期试验中，Selonsertib也显现降低炎症活动和纤维化程度的疗效，但因在Ⅲ期临床试验中期评估未达到改善纤维化的终点指标而宣告终止。经历同样命运的还有泛半胱氨酸蛋白酶抑制剂emricasan，也因Ⅱ期临床试验未达到改善肝纤维化的主要终点而终止。炎症反应引起单核细胞趋化因子（MCP）释放及其受体CCR2/5的激活，使得MCP-CCR2/5阻滞剂cenicriviroc成为治疗NASH的候选靶向药物之一。CCR2/5受体存在于淋巴细胞、Kupffer细胞及HSC表面，cenicriviroc通过抑制这些细胞在NASH形成过程中的炎症反应，降低活化和促进纤维化的信号。因在NASH Ⅱ期临床试验中对纤维化有显著改善，明显优于安慰剂，该药物进入Ⅲ期临床试验。过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）α/σ双重激动剂elafibranor 在Ⅱ期临床试验表现出对NAS改善作用及肝纤维化的缓解，已通过RESOLVE-IT Ⅲ期临床试验中期评估，决定继续按原定的72周方案进行试验。另一PPAR-α/γ 双重激动剂saroglitazer的Ⅱ期临床试验也已完成，NASH患者ALT水平下降44.39%，达到主要临床终点指标。Saroglitazer通过调节脂肪代谢和增强胰岛素敏感性来减少肝内脂肪含量（磁共振PDFF指标）。以奥贝胆酸（OCA）为代表的法尼酯X受体（FXR）激动剂在FLINT Ⅱ期临床试验中取得了较满意的疗效，除改善NAS外，35%的NASH患者肝纤维化得到改善，显著高于安慰剂组的改善率（19%）。Intercept公司宣布长达18个月的REGENERATE Ⅲ期临床试验已达到改善NASH患者肝纤维化的终点目标。奥贝胆酸因此成为首个申请FDA审批的抗NASH纤维化药物。但其18个月临床改善率并不令人满意，相比于安慰剂组11.9%的临床改善率，奥贝胆酸每日25mg和10mg剂量组的临床改善率分别为 23.1%和17.6%。此外，有17%（115/658）患者出现血清低密度脂蛋白升高，51%（336/658）患者出现瘙痒等不良反应，9%患者因瘙痒或其他不良反应而停药。甲状腺素受体-β（THR-β）激动剂MGL3196，也已进入Ⅲ期临床试验。胰高血糖素样肽-1（GLP-1）受体激动剂利拉鲁肽（liraglutide）、成纤维细胞生长因子-21（FGF-21）类似物pegbelfermin-BMS-986036也已完成NASH治疗的Ⅱ期临床试验。
表1介绍了NASH主要靶点及相关药物的作用机制和临床试验进展情况。表2重点介绍了目前已开展Ⅲ期临床试验的代表性药物。


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结语

NAFLD的发病机制及疾病发展过程非常复杂，涉及肝实质细胞、非实质细胞、免疫细胞和多种细胞因子及通路。这些病理生理机制的关键靶点对于开发NASH和肝纤维化非侵入性标记物以及靶向治疗药物十分重要。现有临床治疗主要针对单一靶点和通路，疗效欠佳。因此，开发安全有效并针对NASH和肝纤维化进展的多因素和环节的特异性药物，以及合用作用于不同靶点的药物已成为治疗NASH及肝纤维化的新策略。已完成Ⅱ期临床试验或正开展的Ⅲ期临床试验药物作用于NASH及肝纤维化的多个环节，包括脂质代谢、脂毒性、过氧化应激、胰岛素抵抗、炎症及免疫应答、细胞调亡、肝纤维化和胶原转化等。这些药物除对NASH脂肪积蓄、炎症应答、胰岛素抵抗等过程中的酶、转录因子、脂肪因子或炎症因子受体具有靶向作用外，能否阻止肝纤维化的进展是判断其成为NASH特异性药物的重要标准。其中，FXR激动剂奥贝胆酸、CCR2/5拮抗剂cenicriviroc、PPAR-α/σ双重激动剂elafibranor都不直接抑制对肝纤维化起重要作用的HSC，而是减少肝细胞的脂肪积累、脂毒性、改善胰岛素抵抗、降低肝脏的炎症反应，从而减少对HSC的刺激、阻止肝纤维化的进展。
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